پایان نامه بررسی پتانسیل ریزازدیادی و باززایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه های یکساله یونجه

پایان نامه بررسی پتانسیل ریزازدیادی و باززایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه های یکساله یونجه

مقدمه

یونجه (Medicago sativa L.) یکی از مهم‌ترین گیاهان علوفه‌ای برای تغذیه دام می‌باشد كه با وسعت كشت جهانی بیش از 40 میلیون هکتار، زراعت آن امروزه بسیار توسعه یافته است (زانگ و همكاران 2010). همزیستی یونجه با باكتری‌های ریزوبیوم همزیست و در نتیجه تثبیت نیتروژن، حفظ ساختار مناسب خاک و اثرات بالقوه این گیاه در مدیریت آفات به عنوان مهم‌ترین گیاه تناوبی، اهمیت آن را در كشاورزی پایدار افزایش داده است (قوامی و همكاران، 1377(. یونجه اتوتتراپلوئید (2n = 4X = 32) و دگرگشن بوده و تنوع ژنتیكی زیادی بین ارقام مختلف آن دیده می‌شود. و به دلیل ظرفیت باززایی خوب درون شیشه­ای آن برای یک مدت زمان طولانی از اهداف مطالعات ﮊنتیکی و زیست شناسی سلولی- مولکولی بوده است (اینچوا و همكاران، 2005و شائو و همكاران، 2000). جنس Medicago ترکیبی از گونه­های چند­ساله و یکساله می‌باشد. یونجه­های یکساله در بیش از 250 منطقه جغرافیایی ایران پراکنده هستند که استان آذربایجان غربی یکی از نواحی رویشی آن‌ها است (حیدری شریف آباد و همكاران، 1379). به طور كلی، اگر ژنوتیپ­های یونجه مورد بررسی قرار گیرند، امكان یافتن یك ژنوتیپ با قابلیت باززایی خوب در ژرم پلاسم یونجه وجود دارد (اینچوا و همكاران،2005). افزایش کیفیت و میزان تولید و مقاومت در برابر بیماری‌ها جزء اهداف اصلی برای اصلاح یونجه (.Medicago sativa L) می‌باشد، اما بیشتر دستاوردها در گذشته با استفاده از روش‌های كلاسیك اصلاحی به دست آمده‌اند ، نه از تکنیک‌های مهندسی و این به علت عدم وجود پروتوكل باززایی مؤفق برای طیف وسیعی از ژنوتیپ های یونجه می‌باشد (لی و همكاران،2009). این گیاه دارای سابقه تاریخی طولانی بوده و قدمت آن به ابتدای تاریخ تمدن می‌رسد (قوامی و همكاران، 1377). احتمالا منشا آن ناحیه‌ی كائوكاسوس (Caucasus) یعنی شمال شرقی تركیه، ارمنستان و شمال غربی ایران می‌باشد (میکاد و همكاران، 1988). سازگاری یونجه به دامنه‌ی وسیعی از شرایط آب و هوایی سبب شده است كه این گیاه در بیش از 40 میلیون هكتار از اراضی دنیا كشت شود (زانگ و همكاران، 2010)، كه در این میان آمریكا بیشترین سطح زیر كشت را دارا می‌باشد، بطوریكه آمریكا، اروپای شرقی و آرژانتین به تنهایی %70 مناطق سطح زیر كشت یونجه را به خود اختصاص می‌دهند (ورونسی و همكاران، 2010). در ایران نیز كه از خاستگاه‌های اولیه یونجه بشمار می‌رود، این گیاه در 600 هزار هكتار از اراضی كشور كشت می‌شود كه از این سطح زیر كشت حدود 3/4 میلیون تن علوفه خشك عاید کشاورزان می‌شود (آمارنامه وزارت جهاد كشاورزی، 1388). جنس Medicago به شاخة گیاهان گلدار^[1]، زیرشاخة نهاندانگان^[2]، ردة دولپه‌ای‌ها^[3]، راستة روزالس^[4] و تیرة پاپیلوناسه‌آ^[5] متعلق است كه شامل گونه‌هایی است كه از لحاظ ویژگی‌های مورفولوژیكی بسیار متنوع می‌باشند و حدود دو سوم این گونه‌ها یكساله و بقیه چندساله هستند (لسینز و لسینز، 1979 و ورونسی و همكاران 2010).

1-1-   تاریخچه و خصوصیات گیاه شناسی یونجه

1-1-1- اهمیت و گیاهشناسی یونجه

یونجة زراعی (Medicago Sativa L.) كه ملكه گیاهان علوفه‌ای نیز نامیده می‌شود در بخش وسیعی از اروپا و آمریكا به عنوان مهم‌ترین علوفة لگومی شناخته شده است. این گیاه اغلب جهت مصرف به صورت علوفة خشك، علوفة دِهیدراته، حبه‌های علوفه‌ای، علوفة تازه، کود سبز و گهگاهی چراگاه كشت می‌شود (ورونسی و همكاران2010). بقایای یونجه مواد آلی خاك را افزایش می‌دهد و سیستم ریشه‌ای آن مواد غذایی موجود در اعماق خاك را در بین لایه‌های خاك به حركت در‌آورده و سبب بهبود ساختار خاك، نفوذپذیری نسبت به آب و ظرفیت نگهداری آب می‌شود. كشت یونجه به مقدار كمی به علف‌كش و آفت‌كش نیاز دارد و به دلیل همزیستی باكتری‌های تثبیت كنندة نیتروژن (Sinorhizobium meliloti) با ریشه آن به كود نیتروژنه نیازی ندارد، كه این ویژگی‌ها با ملاحظات ملی و بین‌المللی فعالیت‌های كشاورزی در ارتباط با محیط زیست سازگار می‌باشد. همچنین مزارع یونجه جهت غنی‌سازی تنوع زیستی بسیار مطلوب می‌باشند (ورونسی و همكاران، 2010). این گیاه دارای پروتئین زیادی بوده و حاوی اكثر اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و هیدرات‌های كربن می‌باشد و میزان فیبرعلوفه آن نیز كم می‌باشد (زانگ و همكاران 2010 و مونتیرو و همکاران، 2003).

1-1-2- ژنتیك و گروه‌های مختلف یونجه

جنس Medicago دارای اشكال دیپلوئید و تتراپلوئید M. sativa spp. Sativa،M.Sativa spp. Falcata و M. Sativa spp. Glutinosa می‌باشد، كه این گونه‌ها به آسانی به اهم تلاقی یافته و دارای كاریوتیپ مشابهی می‌باشند. یکی از موانع عمده در تبادل ژن بین آن‌ها سطح پلوئیدی است كه این عامل می‌تواند با تولید گامت‌های كاهش نیافته مرتفع گردد (مک کوی و بینگهام، 1988). اشكال دیپلوئید و گل ارغوانی M. Sativa،  M. Sativa spp. Coerulea نامیده می‌شوند در حالی كه اشكال تتراپلوئید و گل ارغوانی M. Sativa، M. Sativa spp. Sativa نامیده می‌شوند كه یونجه‌های زراعی چندساله معمولاً در این گروه قرار می‌گیرند. در مقابل فرم‌های بالا، M. Sativa spp. Falcate دارای گل‌های زرد رنگ بوده و اشكال دیپلوئید را شامل می‌شود كه دارای 4 گونه چند­ساله تتراپلوئید و دو گونه چندساله هگزاپلوئید می‌باشد (ورنوسی و همكاران، 2010). در حدود 3/1 جنس Medicao را گونه­های یکساله تشکیل می‌دهند که اکثرا دیپلوئید و خودگشن هستند و از بعضی جهات مانند رشد سریع‌تر، کیفیت علوفه ای و مقدار پروتئین خام نسبت گونه­های چند­ساله برتریت نشان می‌دهند (زو و همكاران،1996). یونجه‌­های یکساله (Medic) ممكن است به عنوان یك منبع مفید برای ژن‌های دخیل در صفات زراعی مهم مانند مقاومت به تنش­های زنده و غیر زنده باشند (اینچوا و همكاران، 1999).

1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی

یونجه همدانی: در برابر سرما مقاوم بوده و ارتفاع آن بیش از سایر ارقام سردسیری و نیمه گرمسیری است. به طوری که ارتفاع ساقه به ۸۰ تا ۹۰ سانتی متر می‌رسد. برگ‌های آن کوچک‌تر و نازک‌تر و باریک‌تر از سایر ارقام است. این رقم در ارتفاعات زیاد به خوبی رشد می‌کند. دانه­های آن کوچک و در حدود یک تا ۱/۲ میلی متر است. یونجه همدانی رنگ بنفش دارد و برای کشت در مناطق سرد و مرتفع مناسب است.

قره یونجه: مرکز عمل آوری آن آذربایجان است. در برابر سرما مقاوم است و برای کشت به صورت یونجه یکساله و حتی دیم در مناطق سرد به خصوص آذربایجان مناسب است.

1-2- اهمیت كشت بافت

كشت بافت تكنیكی است كه امكان تولید گیاه در محیط درون شیشه­ای را فراهم می‌کند. اساس این تكنیك توتی پوتانسی است كه بیان می‌کند هر سلول گیاهی دارای كلیه اطلاعات ژنتیكی لازم برای تبدیل شدن به یك گیاه كامل است. بنابراین كشت سلول، بافت یا اندام این امكان را فراهم می‌کند كه با كشت یكی از اجزای فوق سایر قسمت‌های گیاه تشكیل شود. كشت بافت دارای اهداف متعددی است كه از جمله مهم‌ترین آنها می‌توان به موارد زیر اشاره كرد:

1-    پی بردن به نیازهای تغذیه­ای سلول و توانایی سلول

2-    ریزازدیادی یا تكثیر سریع در فضای محدود

3-    فراهم آوردن دست ورزی ژن یا مهندسی ژنتیك

4-    تولید گیاهان هاپلوئید

5-    به نژادی و تهیه نژاد­های مقاوم به شوری وخشكی

6-     رفع مشكلات مربوط به رویش سخت بذرها

7-    كشت پروتو پلاست و هیبریداسیون سوماتیكی

8-    كوتاه كردن مراحل چرخه زندگی گیاه وتسریع گلدهی

9-    طولانی كردن مرحله رویشی در گیاهانی كه قسمت‌های رویشی آن‌ها مصرف می‌شود(مانند یونجه)

10-  تولید گیاهان عاری از ویروس

11-  حفظ ونگهداری ذخایر ژنتیكی

12-  تولید متابولیتهای ثانویه

13-  گلدهی در محیط درون شیشه‌ای

14-  رفع مشكلات خودناسازگاری

از مشكلات كشت بافت می‌توان به انواع آلودگی‌های باكتریایی وقارچی اشاره كرد كه در برخی از موارد كار را با شكست مواجه می‌سازد. همچنین كشت بافت نیاز به تجربه دارد وگیاهان رشد كرده در محیط درون شیشه­ای به شرایط رطوبت بالا عادت کرده‌اند، بنابراین باید مرحله سازگاری را سپری كرده وسپس به خاك منتقل شوند (حسندخت و همكاران،1385).

1-3- کشت بافت گیاهی

ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک­های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه­های گیاهی از کار اولیه مورل (1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمک‌های معدنی توسط موراشیگ و اسکوگ (1962) ناشی شد. از آن به بعد، این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت وامروزه یک نقش کلیدی در تکثیر ، اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا می‌کند.کشت بافت گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است: 1 ـ توانمندی[6]که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است. توانمندی بر این مطلب دلالت می‌کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می‌باشد. گر چه از لحاظ نظری همه سلول­های گیاهی توانمند هستند، با این حال سلول‌های مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند. 2ـ تمایز زدایی[7]، که توان سلول‌های بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلول‌ها با بازتمایزی[8] اندام­های جدیدی را سازماندهی می‌کنند. 3ـ شایستگی[9]، که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می‌کند. برای مثال، سلول­های با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویان­های کاملاً فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح، واژه ناشایستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان می‌شود.

3-1 انواع کشت درون شیشه‌ای :

1 ـ کشت گیاهان کامل ( برای مثال، کشت بذر ارکیده ، کشت دانه رست [10]

2ـ کشت اندام ( برای مثال، کشت مریستم)، کشت شاخساره[11]: کشت ریشه- کشت برگ- کشت به ساک، کشت رویان

3ـ کشت کالوس

4 ـ کشت سلول

5 ـ کشت پروتوپلاست

روش‌های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می‌باشد. یاخته‌ها، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی در طی مرحله تمایز زدایی، توده‌های یاخته‌ای بی‌شکل و متراکمی به نام پینه را تولید می‌نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایز یافته و بافت‌های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می‌آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش‌های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری‌زا، حفظ ذخایـر گیاهی ارزشمند در کشت‌ها و در درجه حرارت‌های پاییـن و اصلاح گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه‌ای است که بسیاری از دانشگاه‌های دنیا آن را در دوره‌های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده‌اند و حتی در بعضی از کشورها دوره‌های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده‌اند (عادلی مسبب، 1378).

یکی از مهم‌ترین مسائل حل نشده در زیست شناسی عمومی، تنظیم رشد و نمو است. یک روش آزمایشی که در پژوهش‌های تنظیم رشد و نمو گیاه، زیاد بکار برده می‌شود، کشت قسمت­های قطع شده گیاهی و ریز نمونه­های بافتی مشخص روی محیط کشت مصنوعی در آزمایشگاه است. اسکوک و همکارانش کشف کردند که اگر بافت آوندی همراه با ریز نمونه­های مغز روی یک محیط کشت شامل اکسین کشت شود، بافت تحریک شده و متحمل تقسیم سلولی می‌گردد. همچنین کشف کینیتین بدین علت مهم بود که مشخص کرد تقسیم سلولی می‌تواند به واسطه ماده شیمیایی ساده­ای تحریک گردد. بنابراین، با کشف کینتین حدس زده شد که ممکن است مولکول‌های طبیعی با

ساختمان مشابه کینتین فعالیت تقسیم سلولی داخل گیاه را تنظیم کنند. که بعضی از سیتوکینین­های مصنـوعی، طبیعی و ترکیباتی مشابه که در کشت بافت استفاده می‌شوند عبارتند از: زآتین، کینیتین (6- فورفوریل آمینو پورین یا N6 – فورفوریل آدنین)، BAP، ZIP، PBA، تیدیازورون. همچنین چندین تنظیم کننده رشد گیاهی که در کشت بافت استفاده می‌شوند شامل: اتیلن، آبسیزیک اسید، سیتوکینین­ها (کینتین)، اکسین­ها (اینولیل 3-استیک اسید) IAA، جیبرلین­ها (جیبرلیک اسید) GA3، زآتین، 2،4- دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D)، نفتالن استیک اسید (NAA). اسکوک و میلر (1957) نمونه بی­نظیری از تنظیم هورمونی ریخت­زایی در ریزنمونه­های مغز توتون ارائه کردند. این تحقیق مهم به طور جالب، اثر متقابل ظریف و کمّی بین اکسین و سیتوکینین در کنترل تشکیل جوانه و ریشه از ریز نمونه­های مغز را نشان داد. با ترکیب خاصی از غلظت­های IAA و کینیتین، بافت مغز به صورت کالوس تمایز نیافته­ای رشد کرد و با تغییر نسبتIAA : KIN  آن‌ها موفق به تولید جوانه یا ریشه از ریز نمونه­ها شدند (آزادی و همكاران، 1382).

[1]. Spermatophyta

[2].Angiospermae

[3].Dicotyledon

[4]. Rosales

[5]. Papilionaceae

[6]-Totipotency

[7]- Dedifferentiation

[8]- Redifferentiation

[9]- Competency

[10]= Seedling

[11]= Shoot tip

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                            صفحه

فصل اول: كلیات

مقدمه .......................................................................................................................................................................................................................................... 2

1-1- تاریخچه و خصوصیات گیاه شناسی یونجه................................................................................................................................................................3

1-1-1- اهمیت و گیاهشناسی یونجه....................................................................................................................................................................................3

1-1-2- ژنتیك و گروه‌های مختلف یونجه...........................................................................................................................................................................3

1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی .......................................................................................................................................................................................4

1-2- اهمیت كشت بافت..........................................................................................................................................................................................................4

1-3- کشت بافت گیاهی .........................................................................................................................................................................................................5

1- 4- تاریخچه کشت بافت یونجه..........................................................................................................................................................................................7

فصل دوم: بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق

2-1- باززایی درون شیشه­ای................................................................................................................................................................................................ 10

2-1-1- باززایی مستقیم در یونجه.......................................................................................................................................................................................10

2-1-2- باززایی غیرمستقیم در یونجه................................................................................................................................................................................13

فصل سوم: روش تحقیق

3-1- رقم مورداستفاده...........................................................................................................................................................................................................24

3-2- محیط کشت، ترکیبات و آماده سازی آن................................................................................................................................................................24

3-2-1- محلول­های ذخیره مواد معدنی برای تهیه محیط کشتSH  .......................................................................................................................34

3-2-2- محلول های ذخیره مواد تنظیم کننده رشد....................................................................................................................................................25

3-3- شرایط كشت، ضد عفونی بذر و کشت ریزنمونه­ها..................................................................................................................................................26

3-3-1- باززایی مستقیم  از گره ساقه.................................................................................................................................................................................26

3-3-2- سازگاری گیاهچه­ها..................................................................................................................................................................................................28

3-4- باززایی غیرمستقیم ..................................................................................................................................................................................................... 28

3- 5- روش و ابزار گردآوری اطلاعات..................................................................................................................................................................................30

3-6- روش آماری و تجزیه داده­ها.........................................................................................................................................................................................30

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل اطلاعات

4-1- القاء جوانه و باززایی .....................................................................................................................................................................................................32

4-1-1- القاء جوانه در محیط کشت  SIM I......................................................................................................................................................................32

4-1-2- باززایی شاخساره در محیط کشت SIM I...........................................................................................................................................................35

4-1-3- القاء جوانه در محیط کشت  SIM II....................................................................................................................................................................37

4-1-4- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II  ........................................................................................................................................................40

4-1-5- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چند­ساله و یکساله در القاء جوانه و باززایی شاخساره در محیط كشت SIM I....................................43

4-1-5-1- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­های چند­ساله در القاء جوانه در محیط كشت  SIM I...........................................................................43

4-1-5-2- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­های یکساله در القاء جوانه در محیط كشت  SIM I..............................................................................43

4-1-5-3- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­ چند­ساله در باززایی شاخساره در محیط كشت  SIM I.......................................................................44

4-1-5-4- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­ یکساله در باززایی شاخساره در محیط كشت  SIM I..........................................................................45

4-1-6- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چند­ساله و یکساله در القاء جوانه و باززایی شاخساره در محیط كشتSIM II....................................45

4-1-6-1- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چندساله در القاء جوانه در محیط كشت SIM II..................................................................................45

4-1-6-2- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­ یكساله در القاء جوانه در محیط كشت  SIM II.....................................................................................46

4-1-6-3- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چند­ساله در باززایی شاخساره در محیط كشت  SIM II.....................................................................47

4-1-6-4- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه یكساله در باززایی شاخساره در محیط كشت  SIM II.........................................................................47

4-2- ریشه­زایی........................................................................................................................................................................................................................48

4-2-1- ایجاد ریشه در یونجه­های چند­ساله......................................................................................................................................................................48

4-2-2- درصد ایجاد ریشه در یونجه­های چند­ساله..........................................................................................................................................................48

4-2-3- درصد ایجاد ریشه در یونجه­های یكساله..............................................................................................................................................................50

4-3- سازگاری و انتقال به شرایط گلخانه...........................................................................................................................................................................50

4-4- القاء كالوس در یونجه­های چند­ساله و یکساله.........................................................................................................................................................51

4-4-1- باززایی غیرمستقیم از كالوس یونجه.....................................................................................................................................................................52

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

5-1- یونجه­های چند­ساله.......................................................................................................................................................................................................55

5-1-1- باززایی مستقیم ........................................................................................................................................................................................................55

5-1-1-1- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................55

5-1-1-2- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO₃ .........................................................................................................56

5-2- یونجه­های یكساله..........................................................................................................................................................................................................56

5-2-1- باززایی مستقیم ........................................................................................................................................................................................................56

5-2-1-1- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................56

5-2-1-2- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO₃...........................................................................................................57

5-3- باززایی غیر مستقیم در یونجه­های چند­ساله و یکساله..........................................................................................................................................59

5-4- نتیجه گیری و پیشنهادات...........................................................................................................................................................................................60

فهرست منابع و ماخذ.............................................................................................................................................................................................................61

 چکیده انگلیسی.......................................................................................................................................................................................................................67

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                            صفحه

جدول 3- 1- ترکیب محلول­‌های ذخیره (50×‌) پنج گروه نمکی غیر آلی فرمولاسیون SH....................................................................................25

جدول 3-2- تركیبهای مختلف تنظیم­کننده­های رشدی مورد استفاده در محیط كشت پایه MS حاوی ویتامینهایB5  برای القاء جوانه و باززایی در ارقام و گونه های مختلف یونجه..........................................................................................................................................................................28

جدول 3-3- تركیبهای مختلف تنظیم­کننده­های رشد مورد استفاده در محیط كشت پایه MS حاوی ویتامین­های B5 برای القاء كالوس در ارقام و گونه­های مختلف یونجه...............................................................................................................................................................................................29

جدول 3-4- محیط كشت­های مختلف حاوی تركیب­های مختلف تنظیم­کننده­های رشدی مورد استفاده برای رشد كالوس در ارقام و گونه­های مختلف یونجه ...................................................................................................................................................................................................................29

جدول 3- 5- تركیب­های مختلف تنظیم­کننده­های رشدی مورد استفاده در محیط كشت پایه MS حاوی ویتامین­های B5 برای باززایی غیر مستقیم در ارقام و گونه­های مختلف یونجه.........................................................................................................................................................................29

جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلفBAP , NAA  بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد................................................................................................................32

جدول 4-2- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلفBAP , NAA  بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در 2 گونه یونجه یکساله  M. rigidula و :M. scutellata.......................................................................................................................................34

جدول 4-3- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلفBAP , NAA  بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.......................................................................................................36

جدول 4-4- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلفBAP , NAA  بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله  M. rigidula وM. scutellata....................................................................................................36

جدول 4-5- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی،  قره یونجه، اردوباد..................................................................................38

جدول 4-6- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله  M. rigidula و M. scutellata...............................................................................39

جدول 4-7- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.............................................................................40

جدول 4-8- نتایج تجزیه واریانس تاثیر محیط كشت­های حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله  M.rigidula و M.scutellata............................................................................42

جدول 4-9- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در سه رقم یونجه چند­ساله.............................................................43

جدول 4-10- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در دو گونه یونجه یکساله.............................................................44

جدول 4-11- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززایی در سه رقم یونجه چند ساله...............................................................44

جدول 4-12- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززایی در دو گونه یونجه یکساله....................................................................45

جدول 4-13- اثر غلظت­های مختلف TDZ به همراه یا بدون AgNO₃ برای القاء جوانه در سه رقم یونجه چند­ساله.......................................46

جدول 4-14- اثر غلظت­های مختلف TDZ به همراه یا بدون AgNO₃ برای القاء جوانه و باززایی در دو گونه یونجه یكساله.........................46

جدول 4-15- اثر غلظت­های مختلف TDZ به همراه یا بدون AgNO₃ برای باززایی در سه رقم یونجه چند ساله............................................47

جدول 4-16- اثر غلظت­های مختلف TDZ به همراه یا بدون AgNO₃ برای باززایی در دو گونه یونجه یكساله.................................................48

جدول 4-17- میزان القاء كالوس در ارقام و گونه­های مختلف یونجه تحت تاثیر محیط کشت­های مختلف CIM............................................51

جدول 4-18- وزن كالوس­های رشد یافته در محیط  CGM در ارقام چند­ساله قره یونجه و همدانی..................................................................52

فهرست اشکال

شكل 3-1- ضد عفونی و كشت بذور یونجه جهت تهیه ریزنمونه..................................................................................................................................27

شکل 4-1- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخساره­زایی و ریشه­زایی در ژنوتیپ­های چند­ساله یونجه......................................................................49

شكل 4-2- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخساره­زایی و ریشه­زایی در دو گونه یونجه یكساله................................................................................51

شكل 4-3- مراحل مختلف باززایی غیرمستقیم یونجه چند­ساله....................................................................................................................................53

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                            صفحه

نمودار 4-1- تاثیر محیط كشت­های  SIM I حاوی سطوح مختلفBAP , NAA  بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.....................................................................................................................................33

نمودار 4-2- تاثیر محیط كشت­هایSIM I  حاوی سطوح مختلفBAP , NAA   بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در 2 گونه یونجه یکساله  M .rigidula و. M. scutellata...........................................................................................................................................................34

نمودار 4-3- تاثیر محیط كشت­های SIM I  حاوی سطوح مختلفBAP , NAA  بر روی صفت میانگین تعداد گیاهچه­های باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.....................................................................................................................................36

نمودار 4-4- تاثیر محیط كشت­های SIM I حاوی سطوح مختلفBAP , NAA   بر روی صفت میانگین تعداد گیاهچه­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله  M .rigidula و. M. scutellata................................................................................................................................37

نمودار 4-5- تاثیر محیط كشت­های  SIM II حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند­ساله همدانی، قره یونجه، اردوباد.......................................................................................................38

نمودار 4-6- تاثیر محیط كشت­های  SIM II حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃  بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله  M .rigidula و. M. scutellata.................................................................................................40

نمودار 4-7- تاثیر محیط كشت­هایSIM II  حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد گیاهچه­های باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم یونجه چند ساله همدانی،  قره یونجه، اردوباد....................................................................................................41

نمودار 4-8- تاثیر محیط كشت­هایSIM II  حاوی سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه یونجه یکساله...........................................................................................................................................................42

نمودار 4-9- درصد ایجاد ریشه تحت تاثیر تركیبات مختلف تنظیم کننده­های رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در سه رقم یونجه همدانی، قره یونجه و اردوباد...............................................................................................................................................................................49

نمودار 4-10- درصد ایجاد ریشه تحت تاثیر تركیبات مختلف تنظیم کننده­های رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در دو گونه یونجه  M. rigidula و  M. scutellata........................................................................................................................................................................50